В качестве лабораторного критерия нормальной репродуктивной функции мужчин часто оценивают структурные нарушения хроматина сперматозоидов: степень упаковки ДНК (анализ ядерных белков) и наличие разрывов цепей ДНК (оценка фрагментации). Нормально сформированный хроматин зрелых сперматозоидов обладает высокой степенью конденсации, что защищает генетический материал от повреждающих воздействий в ходе перемещения по половым путям.
Анализ ядерных белков сперматозоидов
Содержание
| Ремоделирование ядерных белков при сперматогенезе |
| Методы оценки зрелости хроматина |
| Клиническое значение |
| Нет времени читать? |
- Статья проверена
- Дата публикации
- Дата проверки
- Время на чтение: 4 минуты
- Медицинские факты проверены
Данный текст не может быть использована для постановки диагноза, назначения лечения и не заменяет прием врача.
В качестве лабораторного критерия нормальной репродуктивной функции мужчин часто оценивают структурные нарушения хроматина сперматозоидов: степень упаковки ДНК (анализ ядерных белков) и наличие разрывов цепей ДНК (оценка фрагментации). Нормально сформированный хроматин зрелых сперматозоидов обладает высокой степенью конденсации, что защищает генетический материал от повреждающих воздействий в ходе перемещения по половым путям.
Анализ ядерных белков сперматозоидов
Ремоделирование ядерных белков при сперматогенезе
В процессе сперматогенеза происходит последовательная замена соматических ядерных белков на сперматоспецифические: гистоны частично удаляются и замещаются сначала переходными белками, затем протаминами. Протамины — высокоосновные сперматоспецифические белки, обогащённые аргинином; содержание в них цистеина важно для формирования дисульфидных связей, обеспечивающих окончательную стабилизацию и плотность упаковки хроматина. Ремоделирование нуклеопротеидного комплекса начинается на стадии сперматид в яичках и завершается к моменту дозревания в эпидидимисе, где происходит окончательное формирование дисульфидных мостиков.
У человека примерно 85 – 90% ДНК сперматозоидов ассоциированы с протаминами, тогда как около 10–15% остаются в комплексе с гистонами (нуклеогистонами). Снижение степени протаминизации или дисбаланс между долями протамина 1 (P1) и протамина 2 (P2) приводят к увеличению доли участков, сохраняющих гистоны, и к образованию менее плотной упаковки хроматина. Такое состояние повышает уязвимость ДНК к окислительному стрессу и способствует возникновению одно- и двуцепочечных разрывов, то есть фрагментации.
Аномальное соотношение P1/P2 и повышенное содержание нуклеогистонов часто коррелируют с нарушениями параметров спермы — олигозооспермией, астенозооспермией и тератозооспермией — и могут снижать способность сперматозоидов к оплодотворению. Однако чувствительность и прогностическая значимость показателей протаминизации варьируют между исследованиями и зависят от используемых методов.
При замене нуклеогистонов на протамины (P1, P2) формируется более плотная тороидная укладка ДНК, чередующаяся местами с остаточной соленоидной гистоновой укладкой.
Методы оценки зрелости хроматина
Для оценки «зрелости хроматина» применяют различные методики. Окрашивание анилиновым синим (Aniline Blue, AB) выявляет участки с повышенным содержанием стабильных гистонов: интенсивно окрашенные ядра интерпретируют как незрелые по протаминизации. Метод прост и доступен, но преимущественно качественный/полуколичественный и чувствителен к технической подготовке и субъективной оценке оператора. (См фото)
На фотографиях протаминизированные сперматозоиды имеют розовую окраску, а сперматозоиды с нуклеогистонами – синюю. Эмбриолог под микроскопом проводит подсчет окрашенных клеток. Тест даёт понятную картину: сколько процентов сперматозоидов выглядят незрелыми.
Окрашивание Aniline Blue: протаминизированные сперматозоиды (розовые) и с нуклеогистонами (синие)
Окрашивание Aniline Blue
Окрашивание Aniline Blue
Окрашивание Aniline Blue
Для более детальной характеристики используют дополнительные тесты: хромомицин A3 (CMA3) для оценки связывания аргинин-содержащих протаминов, молекулярные методы для определения соотношения P1/P2 (Western blot, массспектрометрия) и тесты фрагментации ДНК (TUNEL, SCSA, SCD).
Клиническое значение
Важно различать понятия «незрелый хроматин» и «фрагментация ДНК»: первое отражает дефекты ремоделирования нуклеопротеидного комплекса и протаминизации, второе — наличие физического повреждения ДНК. Эти процессы взаимосвязаны — незавершённая протаминизация повышает чувствительность ДНК к окислительному повреждению и, следовательно, к фрагментации — но их взаимная корреляция не является абсолютной и зависит от клинического случая и интерпретации исследования.
Клиническое значение исследования зрелости хроматина заключается в дополнительной диагностике мужского фактора бесплодия и выборе репродуктивной тактики (с попыткой естественного зачатия /ВМИ /классического ЭКО /ЭКО+ИКСИ (с разными способами отбора сперматозоидов) /ИКСИ с тестикулярными сперматозоидами /с применением донорской спермы). Интерпретация результатов должна опираться на комплексную оценку параметров спермы, совокупность сведений о пациенте и результаты других лабораторных тестов.
