При работе с биологическими тканями и культурами клеток важно воссоздать условия, максимально приближённые к их естественной среде: температура, pH, ионный состав, осмолярность и наличие ключевых метаболитов напрямую влияют на выживаемость и функциональную активность клеток.
Описание используемых сред для разных манипуляций
Содержание
| Три группы сред |
| Среды для обработки спермы |
| Физиологические среды при пункции фолликулов |
| Среда с гиалуронидазой для очистки ооцитов |
| Инкубационные среды для культивирования эмбрионов |
| HEPES-содержащие среды для работы вне инкубатора |
| Среды для замораживания и размораживания |
| Контроль качества сред |
| Нет времени читать? |
- Статья проверена
- Дата публикации
- Дата проверки
- Время на чтение: 8 минут
- Медицинские факты проверены
Данный текст не может быть использован для постановки диагноза, назначения лечения и не заменяет прием врача.
В программах вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО) эта задача особенно критична — от качества и состава культуральной среды зависит сохранность ооцитов при извлечении их на пункции, оплодотворение, ранний эмбриогенез и, в конечном счёте, вероятность наступления беременности и нормальное ее течение.
Поэтому для разных этапов процедуры — получения и подготовки к оплодотворению половых клеток, проведения самого оплодотворения (в том числе ICSI), культивирования эмбрионов и переноса — разработаны специализированные среды, оптимизированные по компонентам и физико-химическим параметрам, что позволяет обеспечить максимальную жизнеспособность, сохранность и нормальное развитие эмбрионов.
Особый состав сред для замораживания, размораживания биоматериала и точное соблюдение методических инструкций позволяют сохранять жизнеспособность клеток и эмбрионов, давая дополнительные возможности для будущего.
Растворы и среды, используемые в программах ВРТ
Три группы сред
Можно выделить три группы сред:
- физиологические;
- манипуляционные;
- инкубационные.
Физиологические - это среды для операций, создающие условия, близкие к естественным, для поддержания жизнеспособности клеток, манипуляционные – специфические, требующие четкого соблюдения методик при работе с биоматериалом, инкубационные - среды для культивирования, поддержания стабильных условий для развития эмбрионов.
Среды для обработки спермы
Перед использованием спермы для оплодотворения в программах ВРТ ее обязательно обрабатывают:
- удаляют семенную плазму, лейкоциты, мертвые или малоподвижные сперматозоиды;
- выделяют фракцию клеток с наилучшей подвижностью и морфологией.
Для этих процессов необходимы несколько типов сред, каждая из которых решает свою задачу. Базовые среды для промывания и ресуспензии спермы имеют физиологические параметры; работу с ними проводят при комнатной температуре (примерно 20–25 °C). Для разделения фракций эякулята и очистки от сторонних компонентов применяют специфические среды различной плотности в режиме пониженной температуры, для отбора активных сперматозоидов используют вязкую среду (PVP).
Обработка и криоконсервация спермы
Для заморозки биоматериала пользуются средами с криопротектором.
Различными производителями разработаны особые наборы сред для проведения специфических анализов и тестов, не входящих в стандартную спермограмму:
- определение ДНК фрагментации в сперматозоидах;
- оценка целостности мембраны сперматозоидов;
- определение оксидативного стресса;
- биохимический анализ спермы и др.
Физиологические среды при пункции фолликулов
Физиологические среды незаменимы в момент операции, например, во время проведения трансвагинальной пункции фолликулов. После аспирации фолликулярной жидкости фолликул промывают тем же объёмом набранной в шприцы физиологической среды, чтобы «вымыть» оставшиеся ооциты, тем самым минимизировать их потерю. Она не предназначена для длительного культивирования: её задача — сохранить ооциты в первые минуты после извлечения, пока они не будут перенесены в специализированные инкубационные среды. Среда для промывания фолликулов по своему ионному составу и осмолярности приближается к фолликулярной жидкости, что обеспечивает условия для менее травматичного извлечения клеточных структур. Наличие HEPES поддерживает стабильность pH вне инкубационных условий, а включение питательных компонентов способствует сохранению жизнеспособности ооцитов. Гепарин добавляют для снижения агрегации клеток и предотвращения образования микротромбов.
Рис. Фолликулярная жидкость собирается в пробирку, обработанную физиологической средой, салатовыми стрелками показаны полученные ооцит - кумулюсные комплексы
Среда с гиалуронидазой для очистки ооцитов
После получения ооцит-кумулюсных комплексов для удаления клеток, окружающих ооцит, используют среду с добавлением гиалуронидазы. Она нужна для расщепления гиалуроновой кислоты - основного компонента внеклеточного матрикса, удерживающего клетки кумулюса вокруг ооцита. Этот этап обязателен, если клетки готовят для криоконсервации или для оплодотворения неклассическим ЭКО.
Инкубационные среды для культивирования эмбрионов
После чистки в специальной среде клетки помещают в питательную среду в инкубаторы, имитируя условия в фаллопиевых трубах и матке до момента оплодотворения или криоконсервации. В этих же условиях происходит дальнейшее культивирование эмбрионов. Для сохранения клеток, а также развития эмбрионов, оптимальными условиями считаются: физиологический слабощелочной уровень pH ≈ 7,2–7,4, осмолярность в районе 280 mOsm/кг, наличие достаточного количества глюкозы, лактата и пирувата, которые используются клетками для питания. Кроме того, условия в женских половых путях (в фаллопиевых трубах и матке) соответствуют содержанию примерно 5% CO₂, что значительно выше, чем в обычном воздухе (около 0,03%). Чтобы питательная среда в инкубаторах, где эмбрионы находятся в покое, без каких-либо внешних воздействий, работала правильно, необходимо поддерживать определенный газовый состав, уровень влажности и температуру.
В составе сред для культивирования эмбрионов используется бикарбонатный буфер — система, которая удерживает pH в нужном диапазоне, но работает она только при определённой концентрации углекислого газа в воздухе. Поэтому поддержание стабильного газового состава в инкубаторе важный момент при культивировании эмбрионов.
Чтобы дополнительно защитить среду от изменений температуры, испарения и влияния внешней среды, чашки с культуральной средой покрывают стерильным жидким парафиновым маслом. Также под маслом, в маленьких каплях питательной среды, проводят различные манипуляции: оплодотворение, хэтчинг (вскрытие оболочки эмбриона), биопсию и др.
HEPES-содержащие среды для работы вне инкубатора
Однако для работы вне инкубатора необходим HEPES-буфер. Он помогает удерживать pH в оптимальном диапазоне даже на обычном воздухе, когда нет контроля по CO₂.
Рис. Перемещение эмбрионов из питательной инкубационной среды в чашку с каплями среды для эмбриологических манипуляций.
HEPES-содержащие среды применяются для кратковременных этапов работы с биоматериалом: при чистке ооцитов, отборе сперматозоидов для процедуры оплодотворения, при различных манипуляциях с эмбрионами на рабочем столе или на установке вне инкубатора, при подготовке биологического материала к заморозке.
Манипуляции с ооцитами и эмбрионами.
Среды для замораживания и размораживания
Замораживающие и размораживающие среды, не предназначены для длительного пребывания в них живых клеток, поскольку их осмолярность существенно отличается от осмолярности инкубационных сред. Основная задача криоконсервационных сред заключается в постепенном насыщении клеток криопротекторами — веществами, повышающими эффективность витрификации и защищающими их от повреждений при охлаждении.
Насыщение криопротекторами обычно проводят поэтапно: сначала клетки подвергаются умеренному обезвоживанию в растворе с более низкой концентрацией криопротекторов, а затем — в растворе с более высокой концентрацией. Такой подход позволяет постепенно повышать осмолярность среды и уменьшать риск осмотического повреждения клеток, поскольку резкое обезвоживание может привести к их гибели. При этом удаление воды из клеток необходимо, так как именно образование ледяных кристаллов при замораживании является одной из основных причин повреждения клеточных структур (рис. Сравнение результата заморозки и витрификации).
В ходе размораживания криопротекторы необходимо постепенно удалить из эмбриона, однако резкое снижение осмолярности среды недопустимо: быстрый приток воды в клетки, содержащие высокую концентрацию криопротекторов, может вызвать их чрезмерное набухание, повреждение клеточных структур и разрыв клеточной мембраны. Поэтому в стандартных протоколах размораживания используют несколько последовательно сменяющих друг друга растворов: первые из них всё ещё содержат высокую концентрацию непроникающих криопротекторов, например, сахарозы, и благодаря этому поддерживают повышенную осмолярность, обеспечивая постепенное насыщение клеток водой и контролируемое выведение проникающих криопротекторов.
Контроль качества сред
С какой бы целью не использовались среды, важнейшим фактором выбора того или иного производителя является контроль качества. Существует множество тестов, позволяющих оценить пригодность среды для использования во вспомогательных репродуктивных технологиях. В сертификации помимо показателей осмолярности и кислотности для каждой партии продукции, должны прилагаться результаты теста на эндотоксичность (LAL), теста на эмбрионах мышах (MEA) и теста на сохранение жизнеспособности сперматозоидов (SST). Несмотря на подобную сертификацию, в каждой клинической лаборатории перед началом использования желательно проводить независимое тестирование сред и расходников, а также проводить проверку каждого нового лота сред. Только такой контроль может обеспечить высокий уровень качества сред, которые используются при работе с человеческим биоматериалом.
