Метод SCD: дисперсия хроматина сперматозоидов

Обычно цепи ДНК образуют свою трехмерную структуру с помощью белков- гистонов. Однако, в сперматозоидах гистоны заменяются другими белками - протаминами. Вследствие этого меняется трехмерная структура ДНК, образуя плотно упакованные тороиды (бублики). В идеале ДНК в сперматозоиде высокоорганизована, конденсирована и сверхкомпактна, что позволяет в целости и сохранности доставить отцовский генетический материал к ооциту.

Рис. 1

Рис. 2

Упаковка ДНК в соматической клетке (рис. 1) и в сперматозоидe (рис. 2).

Но, учитывая сложность процессов структурного изменения комплекса ДНК как по составу, так и по трехмерной структуре, могут образовываться разрывы ДНК, которые влияют на целостность ядерного материала сперматозоида (фрагментация ДНК). Существуют три основные биологические причины фрагментации ДНК:

• Апоптоз (запрограммированная гибель клетки), запущенный на стадии созревания сперматозоида, когда завершить его уже не получится;
• Моделирование хроматина в процессе созревания сперматозоида;
• Окислительный стресс.

Также на фрагментацию ДНК могут влиять медицинские препараты, пестициды, тяжелые металлы, загрязнители воздуха, продукты курения; некоторые из них действуют напрямую на ДНК, другие через усиление окислительного стресса. Кроме того, среди факторов, влияющих на фрагментацию ДНК, выделяют ожирение, длительное воздержание, а также возраст мужчины.

Мужская субфертильность обуславливает примерно половину всех случаев бесплодия в паре. Параметры, оцениваемые в спермограмме (концентрация, подвижность, морфология), не всегда могут дать полную характеристику исследуемых образцов.

Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов является одним из важнейших методов, способных дать дополнительную информацию о причинах бесплодия, неудачного исхода программы ЭКО, поскольку повреждение ДНК сперматозоидов влияет не только на процессы оплодотворения, развития эмбрионов, наступление и течение беременности, но может сказаться и на постнатальном развитии человека (риск аутизма, ожирения, онкозаболеваний).

Существуют разные методы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах, отличающиеся в способе обнаружения фрагментированных участков. Один из них – SCD (sperm chromatin dispersion test, исследование дисперсии хроматина сперматозоидов). SCD является эффективным и универсальным методом оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах, не требующим использования дополнительного дорогостоящего оборудования. Также необходимо отметить, что существующие методы оценки фрагментации ДНК показывают высокую степень корреляции между собой, что делает метод SCD пригодным для рутинного использования в андрологической лаборатории. SCD позволяет визуально оценить и определить процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК после удаления белков из ее структуры по эффекту гало. Если цепь ДНК целая, то вместо головки сперматозоида будет видно структуру (гало/ореол) похожую на одуванчик, а если ДНК полностью или частично фрагментирована, то ореол отсутствует или имеет малый размер. Если в поле зрения попадает сперматозоид с деградировавшим ядерным материалом, то у него нет никакого ореола, только неравномерно окрашенное или слабоокрашенное ядро.

Фрагменты окрашенных препаратов. Черными стрелками обозначены сперматозоиды с фрагментированной ДНК, красной стрелкой обозначен сперматозоид с деградировавшим ядерным материалом; клетки с «гало» - сперматозоиды с целыми цепями ДНК.

При проведении исследования SCD выделяют пять шагов:

1. Иммобилизация (обездвиживание) сперматозоидов в агарозном геле на предметном стекле;
2. Добавление кислоты для денатурации белков – кислота разрушает ДНК-связанные белки (протамины), выявляя разрывы;
3. Инкубирование образца с лизирующим буфером – буфер удаляет ядерные белки, оставляя "ореолы" хроматина (большие у неповреждённой ДНК, малые/отсутствующие при фрагментации);
4. Окрашивание подготовленного образца – визуализация «гало»;
5. Микроскопия образца (обычно 1000x) с подсчётом ≥300–500 сперматозоидов для определения % фрагментации.

Нормой для метода SCD считается процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК менее 30%! Данное значение определено клиническими исследованиями и рекомендациями производителей тестов, хотя точные референсы варьируют от <15% (строгая норма) до <30% (пограничное значение).