Метод TUNEL: оценка фрагментации ДНК сперматозоидов

Рутинно оцениваемые параметры спермограммы:

• концентрация;
• подвижность;
• морфология.

Эти параметры дают клинически значимую характеристику исследуемых образцов. Однако, не всегда эти параметры достаточны, так как фертильность оценивается не только по абсолютному числу подвижных сперматозоидов, но и по их функциональным возможностям

• целостность/фрагментация ДНК сперматозоидов;
• наличие акросомы и т.д.

Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов является одним из методов, способных дать дополнительную информацию о причинах бесплодия, неудачном исходе программ ЭКО, так как повреждение ДНК сперматозоидов влияет на процессы оплодотворения, развития эмбрионов, наступления беременности, прерывания беременности и даже постнатальное развитие.

Сначала рассмотрим причины появления фрагментации ДНК в сперматозоидах. Сперматозоид проходит несколько стадий развития в процессе созревания и подготовки к оплодотворению. Сперматозоид развивается из сперматогония (стволовой клетки сперматогенеза) в течение 72-75 дней. В этот период изменяется внешняя форма клетки и ее внутреннее строение, в частности, изменяется способ упаковки ядерного материала (ДНК). В соматических клетках ДНК формирует свою трехмерную структуру с помощью белков-гистонов. В сперматозоидах гистоны заменяются другими белками — протаминами. Подобная замена белков ведет к изменению трехмерной структуры ДНК. В идеале ДНК в сперматозоиде должна быть высокоорганизована, конденсирована и сверхкомпактна, что позволяет в целости и сохранности доставить отцовский генетический материал к ооциту по мужским и женским половым путям.

Рис. 1

Рис. 2

Упаковка ДНК в соматической клетке (рис. 1) и в сперматозоидe (рис. 2).

Структурные изменения в комплексе ДНК в процессе созревания сперматозоида могут приводить к возникновению разрывов в ДНК. Существует три основных биологических причины фрагментации ДНК:

• Незавершенный апоптоз (запрограммированная клеточная смерть);
• Ремоделирование хроматина в процессе созревания сперматозоида;
• Окислительный стресс.

Также на фрагментацию ДНК могут влиять некоторые медицинские препараты, пестициды, тяжелые металлы, загрязнители воздуха, продукты курения; некоторые из них действуют напрямую на ДНК, другие через усиление окислительного стресса. Кроме того, среди факторов, влияющих на фрагментацию ДНК выделяют ожирение, длительное воздержание, а также возраст мужчины.

Существуют разные методы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах, отличающиеся в способе обнаружения фрагментированных участков. Один из методов, используемых для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов - TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling). TUNEL - метод основанный на присоединении терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (Tdt) флуоресцентной метки dUTP к свободным 3’-гидроксильным концам одно- и двухцепочечных разрывов ДНК. Оценка флюоресценции может проводиться как при помощи микроскопии, так и с помощью проточной цитофлуориметрии.

1. Подготовительный. Этот этап включает в себя: оценку концетрации и подвижности сперматозоидов как для обычной спермограммы (если TUNEL выполняется с центрифугированием в растворе с градиентом плотности); фиксацию (обездвиживание) сперматозиодов – останавливает метаболизм и сохраняет структуру клеток; пермеабилизацию мембран сперматозоида и оболочки ядра, с помощью детергента создаются микропоры, чтобы доставить флуоресцентную метку в ядро к концам разрывов ДНК; и приготовление мазка из подготовленных сперматозоидов.
2. Второй этап- окрашивание мазка. Очень интересный этап- проводится в темноте(!). На этом этапе происходит нанесение реакционной смеси, состоящей из TdT (терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) и dUTP (дезоксирибонуклеозидом трифосфата с флюоресцентной меткой), на мазок. TdT связывается с 3'-концами разрывов в ДНК и добавляет к ним помеченные dUTP. Этот этап самый длительный, т.к. это не одноступенчатый процесс.
3. Подсчет сперматозоидов с фрагментацией ДНК. Также проводится в темноте. На этом этапе определяют процент сперматозоидов с поврежденной ДНК. Подсчет ведется под флуоресцентным микроскопом: количество сперматозоидов с яркой флуоресценцией (фрагментация ДНК) делят на общее количество сперматозоидов (200 штук) в разных полях зрения, тем самым определяют процент фрагментации. На рис.3 белой стрелкой обозначен сперматозоид с фрагментированной ДНК.

Определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов предоставляет врачу важную информацию для точной оценки андрологического статуса пациента. Это позволяет скорректировать терапевтический подход для повышения эффективности лечения бесплодия и выбрать оптимальный метод подготовки спермы к оплодотворению в активных программах ВРТ.

Выявление высокого процента сперматозоидов с фрагментированной ДНК (>25–30%) требует устранения патогенетических факторов: отказа от курения, коррекции медикаментозной терапии, санации воспалительных процессов в репродуктивном тракте и антиоксидантной поддержки.