Бесплодие в паре в 40-50% случаев обуславливается нарушением в репродуктивной системе мужчин, что может быть, как единственной причиной, так и одним из факторов, способствующих бесплодию.
Метод TUNEL: оценка фрагментации ДНК сперматозоидов
Содержание
| TUNEL |
| Процесс TUNEL включает несколько этапов |
| Нормой считается процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК менее 15% для метода TUNEL |
| Нет времени читать? |
| Лечением данного заболевания занимается | эмбриолог |
| Дополнительная диагностика | Информация о повреждении ДНК, когда стандартной спермограммы недостаточно |
| Прогноз ЭКО | Помогает понять причины неудач оплодотворения и эмбриогенеза |
| Коррекция терапии | Основание для антиоксидантной поддержки и подготовки к ВРТ |
- Статья проверена
- Дата публикации
- Дата проверки
- Время на чтение: 4 минуты
- Медицинские факты проверены
Данная статья не может быть использована для постановки диагноза, назначения лечения и не заменяет прием врача.
Рутинно оцениваемые параметры спермограммы:
- концентрация;
- подвижность;
- морфология.
Эти параметры дают клинически значимую характеристику исследуемых образцов. Однако, не всегда эти параметры достаточны, так как фертильность оценивается не только по абсолютному числу подвижных сперматозоидов, но и по их функциональным возможностям
- целостность/фрагментация ДНК сперматозоидов;
- наличие акросомы и т.д.
Оценка фрагментации ДНК сперматозоидов является одним из методов, способных дать дополнительную информацию о причинах бесплодия, неудачном исходе программ ЭКО, так как повреждение ДНК сперматозоидов влияет на процессы оплодотворения, развития эмбрионов, наступления беременности, прерывания беременности и даже постнатальное развитие.
TUNEL
Сначала рассмотрим причины появления фрагментации ДНК в сперматозоидах. Сперматозоид проходит несколько стадий развития в процессе созревания и подготовки к оплодотворению. Сперматозоид развивается из сперматогония (стволовой клетки сперматогенеза) в течение 72-75 дней. В этот период изменяется внешняя форма клетки и ее внутреннее строение, в частности, изменяется способ упаковки ядерного материала (ДНК). В соматических клетках ДНК формирует свою трехмерную структуру с помощью белков-гистонов. В сперматозоидах гистоны заменяются другими белками — протаминами. Подобная замена белков ведет к изменению трехмерной структуры ДНК. В идеале ДНК в сперматозоиде должна быть высокоорганизована, конденсирована и сверхкомпактна, что позволяет в целости и сохранности доставить отцовский генетический материал к ооциту по мужским и женским половым путям.
Упаковка ДНК в соматической клетке (рис. 1) и в сперматозоидe (рис. 2).
Структурные изменения в комплексе ДНК в процессе созревания сперматозоида могут приводить к возникновению разрывов в ДНК. Существует три основных биологических причины фрагментации ДНК:
- Незавершенный апоптоз (запрограммированная клеточная смерть);
- Ремоделирование хроматина в процессе созревания сперматозоида;
- Окислительный стресс.
Также на фрагментацию ДНК могут влиять некоторые медицинские препараты, пестициды, тяжелые металлы, загрязнители воздуха, продукты курения; некоторые из них действуют напрямую на ДНК, другие через усиление окислительного стресса. Кроме того, среди факторов, влияющих на фрагментацию ДНК выделяют ожирение, длительное воздержание, а также возраст мужчины.
Существуют разные методы оценки фрагментации ДНК в сперматозоидах, отличающиеся в способе обнаружения фрагментированных участков. Один из методов, используемых для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов - TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling). TUNEL - метод основанный на присоединении терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (Tdt) флуоресцентной метки dUTP к свободным 3’-гидроксильным концам одно- и двухцепочечных разрывов ДНК. Оценка флюоресценции может проводиться как при помощи микроскопии, так и с помощью проточной цитофлуориметрии.
Процесс TUNEL включает несколько этапов:
- Подготовительный. Этот этап включает в себя: оценку концетрации и подвижности сперматозоидов как для обычной спермограммы (если TUNEL выполняется с центрифугированием в растворе с градиентом плотности); фиксацию (обездвиживание) сперматозиодов – останавливает метаболизм и сохраняет структуру клеток; пермеабилизацию мембран сперматозоида и оболочки ядра, с помощью детергента создаются микропоры, чтобы доставить флуоресцентную метку в ядро к концам разрывов ДНК; и приготовление мазка из подготовленных сперматозоидов.
- Второй этап- окрашивание мазка. Очень интересный этап- проводится в темноте(!). На этом этапе происходит нанесение реакционной смеси, состоящей из TdT (терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы) и dUTP (дезоксирибонуклеозидом трифосфата с флюоресцентной меткой), на мазок. TdT связывается с 3'-концами разрывов в ДНК и добавляет к ним помеченные dUTP. Этот этап самый длительный, т.к. это не одноступенчатый процесс.
- Подсчет сперматозоидов с фрагментацией ДНК. Также проводится в темноте. На этом этапе определяют процент сперматозоидов с поврежденной ДНК. Подсчет ведется под флуоресцентным микроскопом: количество сперматозоидов с яркой флуоресценцией (фрагментация ДНК) делят на общее количество сперматозоидов (200 штук) в разных полях зрения, тем самым определяют процент фрагментации. На рис.3 белой стрелкой обозначен сперматозоид с фрагментированной ДНК.
Нормой считается процент сперматозоидов с фрагментированной ДНК менее 15% для метода TUNEL.
Определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов предоставляет врачу важную информацию для точной оценки андрологического статуса пациента. Это позволяет скорректировать терапевтический подход для повышения эффективности лечения бесплодия и выбрать оптимальный метод подготовки спермы к оплодотворению в активных программах ВРТ.
Выявление высокого процента сперматозоидов с фрагментированной ДНК (>25–30%) требует устранения патогенетических факторов: отказа от курения, коррекции медикаментозной терапии, санации воспалительных процессов в репродуктивном тракте и антиоксидантной поддержки.
